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差示掃描量熱法如何測量生物分子穩定性
差示掃描量熱法(主要用于表征生物分子（如蛋白質(zhì)）的穩定性。重要的是，它是對其天然形式的生物分子的直接測量。差示掃描量熱法測量可以提供關(guān)于熱穩定性的數據，并作為結構指紋來(lái)評估構象。通過(guò)以恒定速率加熱分子，測量與生物分子熱變性相關(guān)的熱量變化。差示掃描量熱法的優(yōu)點(diǎn);由于差示掃描量熱法依賴(lài)于熱測量，因此可以表征天然生物分子，而不必具有光學(xué)透明的樣品。通過(guò)差示掃描量熱法測量的特性提供了熔化溫度，但也提供了生物分子內折疊和展開(kāi)力的數據。
差示掃描量熱法的用途
差示掃描量熱法經(jīng)常用于藥物開(kāi)發(fā)?？梢允褂脽崃坑嫷囊恍╆P(guān)鍵領(lǐng)域包括：生物治療開(kāi)發(fā)中穩定蛋白質(zhì)和潛在候選物的選擇和表征;配體的相互作用研究;制造和純化條件的優(yōu)化;確定液體制劑的條件;了解基本平衡熱力學(xué)，要了解差示掃描量熱法的工作原理及其可為準確生物分子測量提供的好處，了解基本平衡熱力學(xué)非常重要。本質(zhì)上，蛋白質(zhì)和其他生物分子可以在N和D構象之間轉移：N–結構化、天然和生物活性構象;D–非結構化、變性和無(wú)活性的構象;這種轉移是通過(guò)溫度升高超過(guò)特定范圍而發(fā)生的。該過(guò)程不僅限于蛋白質(zhì)。其他受影響的生物分子包括：有機聚合物;生物大分子，如DNA和脂質(zhì);差示掃描量熱法中使用的儀器;用于差示掃描量熱法測量的關(guān)鍵儀器是熱量計。較新的型號，如差示掃描量熱法，在采樣和分析方面提供了許多自動(dòng)化優(yōu)勢。樣品加載后儀器的無(wú)人值守操作可以節省操作員的時(shí)間，提高工作效率。自動(dòng)化數據分析可以更快地生成高度可重復的熱穩定性數據并符合法規要求。差示掃描量熱法儀器使用和協(xié)議;正確的使用方法和協(xié)議對于確保正確準備儀器和樣品以及安全執行實(shí)驗至關(guān)重要。這些協(xié)議也記錄在美國醫學(xué)圖書(shū)館中。
啟動(dòng)儀器
通用指南可能因儀器而異。如有疑問(wèn)，請務(wù)必查看儀器手冊或聯(lián)系制造商。打開(kāi)熱量計并增加細胞壓力。這可以抑制樣品沸騰和防止氣泡。在大多數熱量計中，使用氮氣。根據制造商的指南調整氮氣壓力。這應該與電池的構成材料一致。將清潔劑儲存器加注到正確的體積。保溫室溫度應設置為正確的值，以在開(kāi)始實(shí)驗前保持樣品完整性。準備樣品;針對作為實(shí)驗參考的緩沖液透析您的樣品。作為替代方案，可以使用在蛋白質(zhì)純化的一步收集的洗脫緩沖液。使用凱氏定氮法或洛瑞法確定樣品的濃度。使用合適的方法。在單個(gè)研究中繼續使用相同的方法來(lái)保持客觀(guān)的結果比較。在真空中對樣品和緩沖液進(jìn)行脫氣。此處的目的是去除可能導致體積不準確的微氣泡。在一些較新的熱量計中，這可以跳過(guò)。此步驟需要在層流生物安全柜中使用微量移液器和無(wú)菌吸頭。成對地將樣品及其緩沖液裝入與熱量計兼容的96孔板中。僅用緩沖液填充前兩對孔，僅用水填充后兩對孔。緩沖液掃描將有助于驗證儀器并建立基線(xiàn)。水掃描將清潔細胞。從生物防護柜中取出孔板之前，確保用密封膜正確密封孔板。這有助于防止污染。將板放入儀器的樣品保存室時(shí)，確保板的方向正確。
實(shí)驗設置參數
在軟件中輸入樣品信息。如果可用，也輸入濃度。如果沒(méi)有，請在數據分析前將濃度值輸入分析軟件。設置清潔選項;根據樣品設置實(shí)驗的起始溫度。如果樣品未知，請從低溫開(kāi)始。設置實(shí)驗溫度。這取決于樣本。選擇實(shí)驗的掃描速率。這也取決于個(gè)別實(shí)驗，但通常為60°C/h、90°C/h或120°C/h。如果您正在掃描未知樣品，建議以不同的速率掃描并檢查樣品內展開(kāi)的動(dòng)力學(xué)。為了確定熱解折疊的可逆性，您應該重新掃描樣品。如果第二次掃描的焓至少是第一次掃描的焓值的80%，則展開(kāi)被認為是可逆的。為了保存熱量計中的細胞，實(shí)驗后將恒溫器設置為10°C;在開(kāi)始實(shí)驗之前，仔細檢查所有參數并確保它們符合實(shí)驗范圍所需的準則。
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